Vergleichende Entwicklung verschiedener Assays für die medizinische Diagnostik und Charakterisierung der funktionellen Oberflächen

Dissertation an der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät der Eberhard Karls Universität Tübingen

Christiane Albrecht
ISBN: 978-3-941216-61-7
Veröffentlicht: Juni 2011, 1. Auflage, Einband: Hardcover, Abbildung und Tabellen: Zahlreiche Abbildungen und Tabellen, z. T. farbig, Seiten 154, Format DIN B5, Gewicht 0.43 kg
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Vergleichende Entwicklung verschiedener Assays für die medizinische Diagnostik und Charakterisierung der funktionellen Oberflächen

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Christiane Albrecht

Vergleichende Entwicklung verschiedener Assays für die medizinische Diagnostik und Charakterisierung der funktionellen Oberflächen

154 Seiten. Zahlr. Abb. u. Tab., z.T. in Farbe. Hardcover,
Preis: 34,80 Euro. ISBN 978-3-941216-61-7.
Rhombos-Verlag, Berlin 2011


Band 7 der Schriftenreihe LIFE SCIENCES

Dissertation der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät der Eberhard Karls Universität Tübingen

Dekan:    Professor Dr. Wolfgang Rosenstiel

1. Berichterstatter:    Prof. Dr. Günter Gauglitz

2. Berichterstatter:    Prof. Dr. Udo Weimar

In dieser Arbeit wird exemplarisch die Entwicklung von Assays für die medizinischen Parameter Neopterin und C-reaktives Protein (CRP) beschrieben. Dabei wird explizit aufgezeigt, dass die strukturellen Eigenschaften der Analyte eine große Rolle spielen und daher bei jeder Assayentwicklung individuelle Anpassungen vorgenommen werden müssen.
Es wird weiterhin eine neue Art der Erkennungsstruktur vorgestellt, welche auch bei der Assayentwicklung für das CRP zum Einsatz kam und über die Möglichkeit verfügt, die Affinität zum Analyten gezielt zu variieren. Es wird untersucht, wie diese Eigenschaft genutzt werden kann und welche Möglichkeiten der Anwendung sich daraus ergeben.
Außerdem werden die eingesetzten funktionellen Oberflächen bezüglich ihrer Eigenschaften untersucht. Dabei wird zum Einen die Signalreproduzierbarkeit verschiedener identisch präparierter Oberflächen verglichen, und zum Anderen die Homogenität verschiedener Oberflächen in einer mikroskopischen Größenordnung betrachtet und ins Verhältnis zu ihrem entsprechenden makroskopischen Signal gesetzt.

Stichworte: Biosensor, medizinische Diagnostik, Immunoassays, Oberflächencharakterisierung



Einleitung
In der modernen Analytik zählen Nachweisreaktionen mittels Immunoassays zu den Routinemethoden. Sie werden heute in allen Bereichen, in denen analytische Kontrollen notwendig sind, eingesetzt. Dazu zählt neben der Umwelt- und Lebensmittelkontrolle insbesonders die klinische Diagnostik.
Vor der Einführung von Immunoassays bestand die Ausrüstung von klassischen Laboratorien aus Großgeräten wie MS (Massenspektrometrie), HPLC (engl. „High Performance Liquid Chromatography“), GC (Gaschromatographie) und AAS (Atomabsorptionsspektroskopie). Die Ausstattung eines solchen Labors ist in der Anschaffung und auch in der Wartung sehr kostenintensiv, weiterhin ist für die Bedienung der Geräte geschultes Personal notwendig. Demgegenüber profitiert man beim Einsatz von Großgeräten von deren Auslegung für einen hohen Analysendurchsatz und damit verbundenen niedrigen Kosten pro Analyse.
Die Kostenverteilung beim Einsatz von Immunoassays verhält sich gegensätzlich. Die Anschaffungskosten einer Grundausstattung sind sehr gering, dafür liegen die Kosten pro Analyse deutlich höher, da die benötigten Reagenzien teuer sind. Daher ergibt sich ein anderes Einsatzgebiet, das nicht für große Probenmengen ausgelegt ist, sondern spezialisierte Einzel-messungen ohne begleitende Laborumgebung bedient.
Dies bedeutet, dass die Nachweismethoden, die auf Immunoassays beruhen, ihre Anwendung in Nischen suchen, die nicht mit den kostengünstigen Großgeräteanalysen konkurrieren. Gebiete, auf denen die Entwicklung der immunoassaybasierten Techniken erfolgversprechend ist, sind die Dezentralisierung, Miniaturisierung und Parallelisierung.
Die beiden ersten Punkte spielen eine entscheidende Rolle für die Entwicklung von sogenannten POCT-Geräten (engl. „Point-of-Care Testing“). Diese patientennahe Labordiagnostik umfasst Nachweismethoden, die nicht im zentralen Analyselabor stattfinden, sondern unmittelbar beim Patienten auf der Krankenstation oder in der Arztpraxis durchgeführt werden. Diese Entwicklung gewinnt zunehmend an Bedeutung, da immer mehr Krankenhäuser Laborleistungen auslagern. Damit steigt die TAT (engl. „turn-around-time“), die Zeit, die von der Probenentnahme bis zum Vor-liegen des Analyseergebnisses vergeht, an. Bei bestimmten Erkrankungen wie z.B. Sepsis (Blutvergiftung) ist eine schnelle Diagnose jedoch häufig lebensrettend und die Möglichkeit, Analysen vor Ort durchzuführen unbedingt erforderlich. Für diese Anwendungen ist es entscheidend, dass die Geräte mobil sind und auch von ungeschultem Personal bedient werden können.
Die Parallelisierung der Methode ist wichtig, wenn mehrere Analyte gleichzeitig in einer Probe nachgewiesen werden sollen. Verwirklicht wird dies häufig in sogenannten Arraystrukturen, in welchen verschiedene Erkennungsstrukturen für verschiedene Analyte zur Verfügung stehen. Die Information wird dann beispielsweise ortsaufgelöst mit bildgebenden Verfahren ausgelesen.
Die Detektion beim Nachweis mittels Immunoassays erfolgt häufig über Fluoreszenzintensitätsmessungen. Dabei wird entweder direkt eine Fluoreszenzmarkierung eingesetzt oder über ein Enzym eine Lumineszenz-reaktion ausgelöst. Über dieses Signal kann bis in sehr niedrige Konzentrationsbereiche hochsensitiv quantifiziert werden, wodurch auf eine vorhergehende Probenaufbereitung, wie z.B. Analytanreicherung, verzichtet werden kann. Die hohe Spezifität verdanken die Immunoassays den Antikörpern, die als Erkennungselement eingesetzt werden.
Zusätzlich werden heute auch neue Erkennungsstrukturen eingesetzt, die sowohl Vorteile in ihrem Herstellungsprozess aufweisen und zusätzliche Eigenschaften besitzen, die einen weiteren Informationsgewinn darstellen. Ein prominentes Beispiel hierfür sind nukleäre Rezeptoren, die Substanzen nicht aufgrund ihrer Struktur sondern aufgrund ihrer Wirkungsweise detektieren (Fechner et al., 2010).

Diese Weiterentwicklungen analytischer Verfahren, die auf der Detektion über Assaytechnik basieren, eröffnen oft neue Möglichkeiten, weswegen es attraktiv ist, Assayentwicklung mit neuen Erkennungselementen zu betreiben.

In dieser Arbeit werden zunächst exemplarisch Assays für die medizinischen Parameter Neopterin und C-reaktives Protein (CRP) entwickelt. Dabei wird explizit aufgezeigt, dass dabei die strukturellen Eigenschaften der Analyte eine große Rolle spielen und daher bei jeder Assayentwicklung individuelle Anpassungen vorgenommen werden müssen.
Es wird weiterhin eine neue Art der Erkennungsstruktur vorgestellt, welche auch bei der Assayentwicklung für das CRP zum Einsatz kommt und über die Möglichkeit verfügt, die Affinität zum Analyten gezielt zu variieren. Es wird untersucht, wie diese Eigenschaft genutzt werden kann und welche Möglichkeiten der Anwendung sich daraus ergeben.
In einem dritten Teil werden die eingesetzten funktionellen Oberflächen bezüglich ihrer Eigenschaften untersucht. Dabei wird zum Einen die Signalreproduzierbarkeit verschiedener identisch präparierter Oberflächen verglichen, und zum Anderen die Homogenität verschiedener Oberflächen in einer mikroskopischen Größenordnung betrachtet und ins Verhältnis zu ihrem entsprechenden makroskopischen Signal gesetzt.



Inhaltsverzeichnis
1    Einleitung    11

2    Theoretischer Teil    15
2.1    Biochemische Grundlagen    15
2.1.1    Aminosäuren, Peptide und Proteine    15
2.1.2    Antikörper    18
2.1.3    Aptamere    20
2.1.4    Scaffolds    21
2.1.5    Biomolekulare Erkennung    26
2.1.6    Assayformate    27
2.1.7    Analyte    30
2.2    Optische Spektroskopie    32
2.2.1    Grundlagen der optischen Spektroskopie    32
2.2.2    Polarisation    34
2.2.3    Reflexion und Brechung    35
2.2.4    Reflektometrische Interferenzspektroskopie (RIfS)    37
2.2.5    Totale Interne Reflexionsfluoreszenz (TIRF)    41


3    Materialien und Methoden    43
3.1    Verbrauchsmaterialien    43
3.1.1    Proteine, Analyte und Antikörper    43
3.1.2    Chemikalien    44
3.1.3    Lösungen    46
3.1.4    Fluoreszenzmarkierungen    47
3.2    Geräte    48
3.3    Methoden    49
3.3.1    Oberflächenchemie    49
3.3.2    Fluoreszenzmarkierung    55
3.3.3    Assayformate    55
3.3.4    Messaufbau RIfS    59
3.3.5    Datenauswertung RIfS    60
3.3.6    Messaufbau TIRF    66
3.3.7    Datenauswertung TIRF    67
3.3.8    Konfokales Laser-Raster-Mikroskop    68

4    Ergebnisse und Diskussion    71
4.1    Assayentwicklung für die medizinische Diagnostik    71
4.1.1    Bindungshemmtest für Neopterin    72
4.1.2    Bindungshemmtest für CRP    79
4.1.3    Sandwichassay für CRP mit zwei Antikörpern    82
4.1.4    Sandwichassay für CRP mit Antikörper und Scaffold    84
4.1.5    Vergleich der unterschiedlichen Assays    91
4.2    Variable Affinitäten der Scaffolds    93
4.2.1    Affinitätsbestimmung mittels RIfS    95
4.2.2    Affinitätsmessungen mittels TIRF    103
4.2.3    Parallele Detektion mittels iRIfS    111
4.3    Oberflächenvergleichbarkeit    114
4.3.1    Chip zu Chip Vergleichbarkeit    114
4.3.2    Mikroskopische Betrachtungen der Oberfläche    123

5    Zusammenfassung und Ausblick    137

6    Literaturverzeichnis    143

7    Anhang    149
7.1    Akademische Lehrer    149
7.2    Lebenslauf    150

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