Untersuchungen an zellulären Rezeptoren mittels Reflektometrischer Interferenz Spektroskopie (RIfS)

Band 6 der Schriftenreihe LIFE SCIENCES

Jan Jaehrling
ISBN: 978-3-941216-59-4
Veröffentlicht: Mai 2011, 1. Auflage, Einband: Hardcover, Abbildung und Tabellen: Zahlreiche zum Teil farbige Abbildungen, Seiten 144, Format 17,6 x 25,0 cm, Gewicht 0.3 kg
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Untersuchungen an zellulären Rezeptoren  mittels Reflektometrischer Interferenz Spektroskopie (RIfS)

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Details

Dissertation an der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät der Eberhard Karls Universität Tübingen

Dekan:                                    Prof. Dr. Wolfgang Rosenstiel
1. Berichterstatter:                Prof. Dr. Günter Gauglitz
2. Berichterstatter:                Prof. Dr. Thomas Chassé



Die Arbeit beschäftigt sich mit der Anwendungsentwicklung für die Reflektometrische Interferenzspektroskopie (RIfS), einer markierungsfreien, direkt-optischen Methode zur Detektion von molekularen Wechselwirkungen, z.B. zur Bestimmung von kinetischen und thermodynamischen Parametern. Die systematische Anwendung der RIfS zur Untersuchung von Interaktionen an zellulären Rezeptoren wurde erstmals für alle Rezeptorklassen anhand von relevanten Modellsystemen untersucht.
Die hier präsentierten Systeme beinhalten transmembranäre Rezeptoren (Y5; ein GPCR), periphere Membranproteine (Ras) und lösliche (Kern-)Rezeptoren (Estrogen Rezeptor a). Deren Interaktion mit physiologischen und synthetischen Liganden, Endokrinen Disruptoren, und deren Metaboliten wird untersucht. Dabei werden die jeweils relevanten Problemlösungen detailliert erläutert (Oberflächenchemie, Entwicklung spezifischer Oberflächenderivate von Liganden, Messung in komplexen Probenmatrices).
Die Ergebnisse zeigen, dass sich die RIfS grundsätzlich zur Messung mit Rezeptoren eignet und eröffnen ihr somit neue Anwendungsgebiete. Darüber hinaus sind die dargestellten Prinzipien allgemein auf Biosensoren anwendbar und ergänzen so das Spektrum der bioanalytischen Methoden.
Schlagworte:
Reflektometrische Interferenz Spektroskopie, Membranrezeptoren, Kernrezeptoren, Charakterisierung von Protein Wechselwirkungen, Assayentwicklung für Bioanalytik


Einleitung

Der rasante Wissenszuwachs in Biochemie, Molekularbiologie, Medizin etc. kurz, den „Life Sciences“ wird begünstigt, reflektiert und oft vorangetrieben durch die Entwicklung und Optimierung von analytischen Methoden, die es ermöglichen, in ausreichender Genauigkeit mit entsprechend hohem Probendurchsatz interessierende Parameter zu messen und damit die entscheidenden Fragestellungen überhaupt erst zu bearbeiten.
Die Gebiete der Methodenentwicklung und der Forschung können oft am besten interdisziplinär bearbeitet werden, und ein Fortschritt in der einen Disziplin zieht nicht selten einen Entwicklungssprung in der anderen nach sich. So wären ohne die Erfindung der Polymerase-Kettenreaktion (engl. polymerase chain reaction, PCR) das Human Genome Project kaum zu verwirklichen gewesen und ohne die Kernspinresonanzspektroskopie (engl. nuclear magnetic resonance, NMR) und Massenspektrometrie (z.B. MALDI-TOF) keine Molekular- und Strukturbiologie in der heutigen Form denkbar.
Unter den optisch-analytischen Methoden, die zur spektroskopischen Untersuchung von biomolekularen Wechselwirkungen zur Verfügung stehen, sind fluoreszenzbasierte und andere Methoden, die sich einer (Farbstoff-)Markierung oder gekoppelter Reaktionen bedienen, weit verbreitet. Sie zeichnen sich i.a. durch bessere Nachweis- und Bestimmungsgrenzen aus, die Größenordnungen unterhalb denen markierungsfreier Methoden liegen. Der damit verbundene geringe Probenbedarf und/oder die geringen Nachweisgrenzen (z.B. im Fall von Fluoreszenzfärbungen) sind im Fall biologischer Proben oft von Vorteil, und ermöglicht teilweise erst die Bearbeitung bestimmter Fragestellungen (z.B. Förster-Resonanz-Energie-Transfer (FRET) [Förster, 1948; Stryer, 1978], Durchflusszytometrie (FACS) [Göhde and Dittrich, 1971], Gleichgewichtstitration in Lösung (Solution Equilibrium Titration (SET)) [Hänel et al., 2005]).
Ihnen gegenüber besitzen direkt optische Methoden allerdings einige Vorteile. Erstens erzeugt die Einführung eines Fluoreszenzfarbstoffs oder anderen Markers (insbesondere, wenn sie statistisch erfolgt) eine Population heterogener Moleküle, da die Label oft in verschiedener Anzahl und an unterschiedlichen Positionen der zu markierenden Moleküle reagieren können. Im schlimmsten Fall können sogar aktive Zentren oder Bindungstaschen markiert, in ihrer Aktivität gravierend verändert und beeinträchtigt oder bei einem markierten Protein eine Umfaltung in eine andere Konformation mit abweichender Aktivität begünstigt werden.
Hinzu kommt, dass u.U. das Label selbst die Eigenschaften des zu untersuchenden Moleküls verändern kann, indem es beispielsweise selbst direkt als Ligand wirkt (z.B. bei einem ansonsten nicht mit dem markierten Molekül wechselwirkenden „Bindungspartner“). Aus diesem Grund ist es bei markierten Proben notwendig nachzuweisen, dass sie sich bezüglich ihrer weiteren Eigenschaften (z.B. Spezifität, Affinität, Aggregationsverhalten) identisch zur unmarkierten Probe verhält. Nicht zuletzt ist die Markierung ein zusätzlicher Arbeitsschritt, der in der Regel mit einer Aufreinigung (Abtrennung nicht umgesetzter Marker) einhergeht und somit Kosten und Zeitaufwand verursacht, sowie zusätzliches Ausgangsmaterial erfordert.
Es ist also anhand der jeweils vorliegenden analytischen Fragestellung zu entscheiden, welcher Ansatz der vorteilhafteste ist. Bei der Untersuchung von Biomolekülen, insbesondere von recht empfindlichen Proteinen wie Rezeptoren ist jedenfalls eine Weiterentwicklung der markierungsfreien Methoden wünschenswert und vorteilhaft. Der bestehende Bedarf wird durch die „boomende“ Entwicklung markierungsfreier Methoden und Geräte im Bereich der Bioanalytik eindrucksvoll unterstrichen: [Akubio], [Attana], [Biacore], [Biametrics], [Corning], [Fortebio] sind nur einige Beispiele für kommerzielle Anbieter markierungsfreier Techniken.
Die Reflektometrische Interferenz Spektroskopie (RIfS) ist eine markierungsfreie, direkt optische Methode, mit der sich Interaktionen von Bindungspartnern an einer Grenzfläche, also in heterogener Phase, zeitaufgelöst untersuchen lassen. Unter anderem wurde sie bereits erfolgreich zur Untersuchung einer Vielzahl von biologisch relevanten Wechselwirkungen, wie  Antigen-Antikörper-Wechselwirkungen [Piehler, 1997], sowie zur Untersuchung der Interaktionen von Oligonukleotiden [Pröll et al., 2005] und dem Ausbreitungsverhalten von Zellen verwendet [Möhrle et al., 2006]. Insofern war davon auszugehen, dass die RIfS prinzipiell auch für die Untersuchung von zellulären Rezeptoren geeignet ist.

Zielsetzung der Arbeit

Zum Zeitpunkt der Entstehung dieser Arbeit war lediglich eine einzelne Anwendung der RIfS zur Untersuchung an Membranrezeptoren beschrieben worden [Hänel, 2003]. In der vorliegenden Arbeit soll allgemein untersucht werden, ob die RIfS zur Untersuchung von allen zellulären Rezeptorklassen geeignet ist. Dies soll durch Experimente mit typischen Vertretern der einzelnen Klassen gezeigt werden.
Um dies für transmembranäre Rezeptoren zu demonstrieren, sollen hier Messungen an solchen Rezeptoren in ihrer natürlichen (Membran-)Umgebung mit Hilfe der RIfS gezeigt werden. Als Beispiel dazu dient der Neuropeptid Y Rezeptor, ein G-Protein-gekoppelter Rezeptor.
Als Beispiel für periphere Membranproteine und -rezeptoren soll durch Untersuchungen an  dem mit einem Lipid-Anker versehenen Protein Ras gezeigt werden, wie seine Insertion in Membranen verfolgt werden kann und wie sich die Interaktion eines spezifischen Bindungspartners mit solcherart auf den Sensor aufgebrachten Proteinen beobachten lässt.
Um die prinzipielle Eignung der RIfS zur Untersuchung der Klasse der intrazellulären Rezeptoren zu zeigen, sollen in dieser Arbeit Messungen mit einem ligandenbindenden Rezeptor und Transkriptionsfaktor, dem Estrogen Rezeptor (ER), vorgestellt werden. Zudem soll die funktionelle Untersuchung von potentiellen Endokrinen Disruptoren (EDCs) gezeigt werden. Als Anwendungsbeispiele der Untersuchung von potentiell hormonell wirksamen Substanzen mit Hilfe der RIfS sollen hierbei neben Messungen mit gereinigten Proteinen und anderen Reinsubstanzen in Puffern auch Messungen in anderen relevanten Probenmatrices demonstriert werden.



Inhaltsverzeichnis

1 Einleitung ............................................................................................... 1
1.1 Motivation der Arbeit ............................................................................. 1
1.2 Zielsetzung der Arbeit ........................................................................... 3
2 Theorie .................................................................................................. 5
2.1 Biochemische Grundlagen ................................................................... 5
2.1.1 Rezeptoren und Signaltransduktion ................................................. 5
2.1.2 Lipide und Membranen ................................................................... 14
2.1.3 Cytosolische Rezeptoren, Transkriptionsfaktoren .......................... 18
2.1.4 Molekularer Mechanismus der Konformationsänderung ................ 21
2.2 Optische Grundlagen .......................................................................... 30
2.2.1 Reflexion und Brechung ................................................................. 30
2.2.2 Reflexion und Interferenz an einer dünnen Schicht ....................... 32
2.2.3 Mehrfachreflexion und Interferenz an dünnen Schichten ............... 35
2.2.4 Reflektometrische Interferenz Spektroskopie ................................. 36
2.3 Physikalisch-chemische Grundlagen .................................................. 38
2.3.1 Biomolekulare Wechselwirkungen.................................................. 38
2.3.2 Detektion an Grenzschichten, Biomolekulare
Interaktionsanalyse (BIA)................................................................ 41
2.3.3 Kinetisch kontrollierte Reaktionen .................................................. 42
2.3.4 Diffusionskontrollierte Reaktionen .................................................. 44
3 Materialien und Methoden................................................................... 48
3.1 Chemikalien und Lösungen ................................................................ 48
3.1.1 Chemikalien .................................................................................... 48
3.1.2 Lipide, Proteine und DNA ............................................................... 50
3.1.3 Lösungsmittel und Puffer ................................................................ 52
3.2 Trägermaterialien ................................................................................ 53
3.3 Geräte ................................................................................................. 53
3.3.1 RIfS: Apparativer Aufbau ................................................................ 53
3.4 Methoden ............................................................................................ 55
3.4.1 Methoden Oberflächenchemie ........................................................ 55
3.4.2 Methoden Vesikel und membranäre Rezeptoren ........................... 60
3.4.3 Methoden Kernrezeptoren (Nuclear Receptors, NRs) .................... 63
3.4.4 Synthese von immobilisierbaren DES-Derivaten ............................ 67
3.4.5 Probenvorbereitung und -handhabung bei RIfS-Messungen ........ 69
4 Ergebnisse und Diskussion ................................................................. 71
4.1 Ergebnisse Membranen und Vesikel .................................................. 73
4.1.1 Zusammensetzung der Membranen ............................................... 73
4.2 Ergebnisse membranäre Rezeptoren ................................................. 79
4.2.1 Ergebnisse Transmembranrezeptoren (NPY Rezeptor Y5) .......... 79
4.2.2 Ergebnisse periphere Membranproteine (Ras) .............................. 85
4.3 Ergebnisse Kernrezeptoren (Nuclear Receptors, NRs) ...................... 91
4.3.1 Immobilisierung von Kernrezeptoren und
deren Bindungsdomänen (LBDs) ................................................... 91
4.3.2 Oberflächenmodifikation mit spezifischen NR Liganden ................ 91
4.3.3 Messungen mit reinen Liganden..................................................... 96
4.3.4 Messungen mit Zellkulturmedien / metabolisierten Liganden ...... 107
4.3.5 Messungen mit DNA-Erkennungsmotiven .................................... 111
5 Zusammenfassung und Ausblick ...................................................... 115
6 Literaturverzeichnis ........................................................................... 119
7 Anhang .............................................................................................. 128
7.1 Abkürzungen und Akronyme ............................................................ 128
7.2 Vorträge und Veröffentlichungen ...................................................... 130
7.2.1 Vorträge ........................................................................................ 130
7.2.2 Poster............................................................................................ 130
7.2.3 Veröffentlichungen ........................................................................ 131
7.3 Akademische Lehrer ......................................................................... 133
7.4 Lebenslauf ........................................................................................ 134

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