Spectro–Microscopy of Autofluorescent Biomolecules

Band 9 der Schriftenreihe LIFE SCIENCES

Sébastien Peter

Kurzübersicht

Fluorescence microscopy has become an indispensable tool in life sciences. The information within a microscopic image can be largely extended by the simultaneous acquisition of spectral information from a microscopic volume because fluorophores act as sensors to their nano-environment. In this work, different classes of autofluorescent biomolecules are spectro–microscopically investigated.
ISBN: 978-3-944101-99-6
Veröffentlicht: 27.10.2014, 1. Auflage, Einband: Hardcover, Abbildung und Tabellen: z.T. farbig, Seiten 182, Format B5, Gewicht 0.49 kg
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Spectro–Microscopy of Autofluorescent Biomolecules

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Sébastien Peter

Spectro–Microscopy of Autofluorescent Biomolecules

Dissertation der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät der Eberhard-Karls-Universität Tübingen.

Band 9 der Schriftenreihe LIFE SCIENCES.

182 Seiten. Zahlreiche,  zum Teil farbige Abbildungen.

Hardcover. Format B5. Preis: 44,00 Euro. ISBN 978-3-944101-99-6.

Rhombos-Verlag, Berlin 2014

Fluorescence microscopy has become an indispensable tool in life sciences. The information within a microscopic image can be largely extended by the simultaneous acquisition of spectral information from a microscopic volume because fluorophores act as sensors to their nano-environment. In this work, different classes of autofluorescent biomolecules are spectro–microscopically investigated. It is shown that the photophysical properties of GFP derivatives largely depend on the composition of the surrounding protein shell, allowing for a better understanding of these proteins. Furthermore, the spectro–microscopic investigation of photosystems in living plant cells enables the observation of adaptation processes of plants to external and internal growth conditions. The parallel implementation and establishment of novel spectro–microscopic modalities further extends the accessible parameter space, offering even deeper insights into the photophysics of autofluorescent biomolecules.

Key words:

Fluorescence, Spectroscopy, Microscopy, Green Fluorescent Protein, Spectral Imaging

 

Dekan: Professor Dr. Wolfgang Rosenstiel

Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät an der Eberhard-Karls-Universität Tübingen

http://www.ti.uni-tuebingen.de/Wolfgang-Rosenstiel.191.0.html

1. Berichterstatter: Prof. Dr. Alfred J. Meixner

Eberhard-Karls-Universität Tübingen, Institut für Physikalische und Theoretische Chemie

http://www.uni-tuebingen.de/Meixner/

2. Berichterstatter: Prof. Dr. Klaus Harter

Zentrum für Molekularbiologie der Pflanzen (ZMBP) an der Eberhard-Karls-Universität Tübingen

http://www.uni-tuebingen.de/de/5078

3. Berichterstatter: Prof. Dr. Thomas Huser

Fakultät für Physik, Arbeitsgruppe Biomolekulare Photonik, Universität Bielefeld

http://www.physik.uni-bielefeld.de/biopho/index.php/en/

 

Introduction

Natural sciences often address problems that, due to the size of their functional units, cannot be intrinsically perceived by human beings. In life sciences, this scale is often defined by their most relevant object which is a single cell, too small in most cases to be observed by the unaided eye. Any observation of cellular processes therefore relies on instrumentation that magnifies cells to a detectable scale.

The most relevant tool is the microscope, in its simplest form consisting of one single lens. Microscopy has become an independent discipline, providing dozens of methods for nearly any demand. Very high sensitivity—in fact at the ultimate limit of single–molecule detection—and image contrast is achieved in fluorescence microscopy. In addition, fluorescence microscopy provides a diffraction–limited resolution in the sub–micrometer regime, allowing for subcellular localization of a signal. In contrast to other methods, fluorescence originating from chemically different emitters can often be distinguished which allows for multiplexed imaging of cells. Furthermore, fluorophores are sensors of their nanoenvironment [1]. Thus, the fluorescence properties of an emitting species depend on its immediate surrounding such as e.g. local pH, refractive index and ion strength. A readout of the spectral information therefore provides additional information to the spatial origin of a fluorescence signal. This potential of functional imaging in living cells is a unique feature to fluorescence microscopy. The readout of spectral information on a microscopic scale, either time– or frequency–resolved, is summarized in the field of spectro–microscopy.

Within a cell, most structures show either no or only weak fluorescence. Therefore, many investigations employing fluorescence rely on attachment of a fluorescent label to the structure under investigation. Chemical fluorophores often provide favorable photophysical properties such as a high brightness and photostability. However, they need to be introduced externally and are often—to a certain extent—toxic to living cells. Moreover, the exact stoichiometry of the labeling is difficult to control and the behavior of a living cell to such a treatment hardly predictable. Non–toxic labels that offer stoichiometric labeling, best produced by the host organism itself, are therefore desperately required. These demands are met by autofluorescent proteins (AFPs), a class of proteins represented by the widely known green fluorescent protein (GFP), first identified in the jellyfish Aequorea victoria [2]. AFPs form their fluorophore in an autocatalytic way [3] with no cofactor other than molecular oxygen required. By attachment of the DNA that encodes for an AFP to the DNA of any cellular protein, the fluorescent label is produced during translation of the genetic information. The labeling is typically non–toxic and permanent, allowing to monitor cells over a long time. While 20 years ago only one AFP was available, namely GFP, a whole family of autofluorescent proteins covering the full visible spectrum has been designed [4], both by targeted and by random mutagenesis as well as by discovery of ever new variants in other maritime organisms. Constant engineering of these proteins has led to functional fluorescent reporters exhibiting a spectral response in dependence of their specific environment [5,6]. This makes AFPs a powerful tool in spectro–microscopic imaging of living cells.

A completely label–free readout is provided when the structure under investigation is fluorescent on its own. In plants, the chlorophylls in chloroplasts efficiently collect light which is used for photosynthesis. A small portion of the absorbed light, however, is released as fluorescence, providing a signal in the far–red and near–infrared region of the electromagnetic spectrum [7]. Since chloroplasts are fully packed with pigments, the signal they provide is strong enough to allow for spectro–microscopic  imaging.

AFPs and chlorophylls thereby represent autofluorescent biomolecules that can be employed for functional studies in vivo. A robust interpretation of the experimental results, however, relies on a precise knowledge of the behavior of these biomolecules in different environments. Furthermore, the young field of spectro– microscopy still requires an expansion of spectral modalities that can be read out.

This thesis therefore addresses different aspects of spectro–microscopy of autofluorescent biomolecules. In a first part, different autofluorescent proteins are thoroughly analyzed in vitro. After that, the potential of spectro–microscopy is utilized in an exemplary study where protein–protein interactions in living plant cells are under investigation. Subsequently, a novel spectro–microscopic method is presented, allowing for probing the excitation spectrum of a single emitter. Chloroplasts of plants exhibiting different external and internal conditions are analyzed by means of emission and excitation spectroscopy in the next section, and the potential of combining different spectro–microscopic readout techniques at the same photophysical system is discussed. The last section gives an outlook on the potential of implementing spectroscopy in novel super–resolution techniques called nanoscopy.

 

Summary

In this work, spectro–microscopic investigations were carried out with different auto–emitting biomolecules. Two different classes of molecules were explored: autofluorescent proteins (AFPs) and chloroplast photosystems (PSs). The former are composed as core–shell systems, with a central chromophore largely shielded from the environment by the protein shell. The latter are complicated multichromophoric systems engaged in photosynthesis.

In a first part (sections 4 and 5), autofluorescent proteins (AFPs) were investigated in vitro for determination of their fundamental photophysical characteristics and parameters. The redox–sensitive green fluorescent protein roGFP2 exhibits two absorbance bands, attributed to the protonated and the deprotonated form of the chromophore. It was found that this equilibrium shifts in dependence of the oxidation state of the protein. In context with ab initio calculations, one amino acid, His148, was identified that was postulated to play a major role in the protonation equilibrium. Mutation of this amino acid by neutral glycine indeed revealed an altered protonation behavior of roGFP2. Furthermore, it was found that the fluorescence lifetime of the deprotonated chromophore also depends on the oxidation status of the protein. It could be shown that the key factor is an altered fluorescence quantum yield. Single–molecule studies indicate that the mechanism underlying these observations is due to altered molecular dynamics, more precisely a change in the rigidity of the protein structure in dependence of roGFP2’s redox state.

In section 5, complexes that form by bimolecular fluorescence complementation (BiFC) were under investigation. BiFC relies on the fact that two non–fluorescent fragments of an autofluorescent protein reconstitute their fluorescence when brought into close proximity. For instance, this is the case when fusing the fragments to two different proteins which closely approach each other by an interaction event. BiFC complexes also form from fragments originating from different AFPs, however with unknown photophysical parameters. An investigation of these parameters is hindered because the AFP fragments used in BiFC are insoluble ex vivo. The problem was successfully addressed here by directly fusing the coding DNA for the AFPs together, yielding soluble chimeric AFPs. Nine different fluorescent proteins were purified and thoroughly analyzed. In more detail, these proteins show different spectra, depending on the distinct composition. Furthermore, the chromophores’ protonation equilibria in the ground and excited states were identified to depend on single amino acid mutations. The fluorescence lifetimes and the fluorescence quantum yields were determined along with the radiative and non–radiative excited state decay–rate constants. This investigation revealed that, depending on the chromophore, single amino acid substitutions greatly enhance or inhibit fluorescence. Finally, the rigidity of these proteins was probed by means of single–molecule spectroscopy.  This disclosed that, in general, very bulky amino acid substitutions lead to a reinforcement of the AFP shells. However, single mutations turned out to exhibit more complicated effects that can only be understood when taking into account the full AFP context.

Whereas AFPs were thoroughly analyzed in vitro in sections 4 and 5, they were utilized in a typical in vivo application in chapter 6, namely in order to show protein–protein interactions. Eight putative interactors of the A. thaliana protein kinase CPK3 that were identified in a screen based on bimolecular fluorescence complementation were checked for interaction in vivo. Here, AFPs forming FRET–pairs were fused to the interaction pairs. The reduction of fluorescence lifetime of the FRET donor upon energy transfer was shown by fluorescence lifetime imaging (FLIM). In the study presented here, labeled CPK3 and its putative interactors were heterologously expressed in Tobacco epidermal leaf cells. Four proteins could be fully confirmed to interact with CPK3, others were not continuosly found to interact, depending on the applied method and the chosen expression system. The results showed that fluorescence lifetime spectroscopy is a valuable complementation to the pool of biological methods, however with the benefit of being accessible in vivo. Overall, the data obtained with different methods demonstrates that FRET–FLIM, BiFC and localization studies represent complementary methods and often need to be applied simultaneously.

In section 7, a novel type of microscope allowing for measuring the excitation spectrum using a confocal beam path was established. To this end, a confocal microscope capable of detecting single molecules was combined with a supercontinuum white light laser for excitation and a grating monochromator for wavelength selection. The capability of this approach was demonstrated by measuring the excitation spectra of single semiconductor nanocrystals, often referred to as quantum dots. The spectra revealed the typical features indicative of single–molecule observation, such as blinking and bleaching in a single step. The observation of single emitters was furthermore confirmed by analyzing the photon stream emitted by the single Qdots in antibunching studies. The Qdots were shown to exhibit very similar spectral features when excited at energies considerably beyond the band gap. However, decided differences were found at the band gap region, originating from the individual size of the Qdots. Furthermore, several wavelengths were identified where the Qdots exhibited an enhanced probability for a transition into a dark state. The exact reason for this, however, still remains speculative.

The microscope described in section 7 was further employed in chapter 8. In more detail, spectro–microscopic studies were performed on chloroplasts of living A. thaliana plants. The plants differed in their growth conditions (more precisely, in the duration of the photoperiod) and in the expression level of the NADP malic enzyme (NADP–ME). Overexpression of NADP–ME led to a shortage of carbon supply and a dwarfed growth phenotype when these plants were grown at short photoperiods. By emission spectro–microscopy, it was shown that these phenotypes are accompanied by a disparate ratio of the plant photosystems I and II. A careful statistical analysis revealed these differences even in plants that showed no different physiological phenotype. The interior of the light harvesting apparatus in the photosynthetic systems was probed by means of fluorescence excitation spectroscopy. It was shown that plants with different NADP–ME expression levels exhibited a different light harvesting capacity. This is attributed to a different embedding of the photosynthetic pigments into the protein backbone which alters the energy transfer efficiency within the energy transfer cascade. This insight purely relies on in vivo studies because any method that investigates photosynthesis in vitro inevitably destroys the cellular context.

Chapters 4 to 8 employed confocal microscopy with a diffraction–limited resolution. Novel techniques make use of the saturable light–induced switching of molecules between different states to break the diffraction barrier. These methods are occasionally referred to as nanoscopy. Up to now, nanoscopy has been successfully used in imaging; however, the spectral information intrinsically present in fluorescence studies has not yet been employed. In this chapter, the applicability of spectro–nanoscopy has been discussed. A way to combine fluorescence lifetime imaging and stimulated emission depletion microscopy (STED) has been proposed. In more detail, the fluorescence evolution after pulsed fluorescence excitation and depletion has been analyzed. It has been shown that the length of the light pulses that is typically used in STED is compatible with an accurate determination of the fluorescence lifetime. Furthermore, it was shown that the stimulated emission efficiency of fluorophores in solution depends on the size of the used fluorophore with small molecules exhibiting a lower efficiency than bigger ones because rotational diffusion is faster for molecules with a small hydrodynamic radius. This is expected to be useful for live cell imaging because autofluorescent proteins with a comparably large size are often employed. The determination of the relevant imaging parameters requires a detailed knowledge of the photophysical parameters of the employed chromophore, in essence closing the circle to chapter 4.

 

German Summary

In dieser Arbeit wurden spektro–mikroskopische Untersuchungen an autoemittierenden Molekülen durchgeführt. Zwei verschiedene molekulare Spezies wurden untersucht: Autofluoreszierende Proteine (AFPs) und Photosysteme (PSs). AFPs bilden ein sog. core–shell system, bestehend aus einem zentralen Chromophor, der durch die Proteinhülle weitestgehend von der Umgebung des Proteins abgeschirmt wird. Photosysteme sind komplizierte multichromophore Systeme und spielen eine zentrale Rolle bei der Photosynthese.

In einem ersten Teil (Kapitel 4 und 5) wurden autofluoreszierende Proteine in vitro untersucht, um ihre grundlegenden photophysikalischen Eigenschaften und Parameter zu bestimmen. Das redox–sensitive grün fluoreszierende Protein roGFP2 weist zwei Absorptionsbanden auf, welche einer protonierten und einer deprotonierten Form des Chromophors zugeordnet werden. Die Gleichgewichtslage zwischen diesen beiden Formen wird durch den Redox–Zustand dieses Proteins beeinflusst. Im Zusammenspiel mit ab initio Rechnungen wurde eine Aminosäure, His148, identifiziert, welche mutmaßlich eine Schlüsselrolle bei der Einstellung des Protonierungsgleichgewichts spielt. Der Austausch dieser Aminosäure durch neutrales Glycin führte zu einer geänderten Gleichgewichtslage und einem geänderten Protonierungsverhalten von roGFP2. Des weiteren wurde festgestellt, dass die Fluoreszenzlebenszeit des deprotonierten Chromophors ebenfalls vom Redox–Zustand des Proteins abhängt und der entscheidende Faktor eine geänderte Fluoreszenzquantenausbeute ist. Die spektralen Verteilungsbreiten, welche mittels Einzelmolekülspektroskopie für reduziertes und oxidiertes roGFP2 bestimmt wurden, deuten darauf hin, dass diesen Veränderungen in den photophysikalischen Parametern eine Veränderung der Molekulardynamik zugrunde liegt. Dies bedeutet, dass sich die Flexibilität der Proteinhülle in Abhängigkeit des Redox–Status des Proteins verändert.

In Abschnitt 5 wurden Komplexe der sog. Bimolekularen Fluoreszenzkomplementation (BiFC) untersucht. BiFC beruht darauf, dass die Fluoreszenz zweier nicht–fluoreszierender AFP–Fragmente wiederhergestellt wird, wenn diese räumlich sehr nahe zusammengebracht werden. Dies geschieht etwa dann, wenn diese Fragmente genetisch an verschiedene Proteine geheftet werden, welche spezifisch interagieren. BiFC–Komplexe können auch mit Fragmenten von unterschiedlichen AFPs gebildet werden, wobei die photophysikalischen Eigenschaften solchartiger Komplexe nicht geklärt sind. Eine Bestimmung dieser Eigenschaften wird dadurch erschwert, dass Fragmente von AFPs ex vivo unlöslich sind. Dieses Problem wurde hier gelöst, indem die für die einzelnen Fragmente kodierende DNA ligiert wurde, was zu löslichen sog. “chimären” AFPs führte. Hier wurden neun unterschiedliche fluoreszierende Proteine aufgereinigt und in vitro charakterisiert. Diese Proteine zeigten, abhängig von der jeweiligen Zusammensetzung, unterschiedliche spektrale Eigenschaften. Des weiteren wurde gezeigt, dass das Protonierungsgleichgewicht des Chromophors, sowohl im Grund– als auch im angeregten elektronischen Zustand, durch einzelne Aminosäurensubstitutionen in der Proteinhülle maßgeblich beeinflusst wird. Die Fluoreszenzlebenszeiten und die Quantenausbeuten wurden bestimmt, was im Hinblick auf den Zerfall des angeregten elektronischen Zustands Rückschlüsse auf die strahlenden und nicht–strahlenden Ratenkonstanten erlaubt. Es stellte sich heraus, dass in Abhängigkeit des Chromophors einzelne Aminosäuresubstitutionen die Fluoreszenz des Chromophors deutlich stärken oder schwächen können. Zu guter Letzt wurde die Stabilität dieser Proteine mittels Einzelmolekülspektroskopie untersucht. Hierdurch wurde deutlich, dass Aminosäuren mit großem Platzbedarf insgesamt zu einer Versteifung der Proteinhülle führen. Andererseits wurden einzelne, weitere Substitutionen identifiziert, welche ein komplexeres Wirkungsspektrum aufweisen. Dieses kann nur verstanden werden, wenn der Gesamtkontext, also die Zusammensetzung des fluoreszierenden Proteins insgesamt, berücksichtigt wird.

Während in den Abschnitten 4 und 5 AFPs in vitro untersucht wurden, wurden sie in Kapitel 6 in einer typischen in vivo Anwendung eingesetzt, nämlich zur Untersuchung von Protein–Protein Interaktionen. Die Interaktion der Proteinkinase CPK3 aus A. thaliana mit acht verschiedenen Proteinen, welche mittels eines Screening–Verfahrens identifiziert wurden, sollten im Rahmen dieser Arbeit näher untersucht werden. Das angewandte Screening–Verfahren basierte dabei auf der Bimolekularen Fluoreszenzkomplementation. Im vorliegenden Teil wurden die potentiellen Interaktionspaare mit unterschiedlichen AFPs, welche FRET–Paare bilden, markiert. Energietransfer macht sich durch eine Verkürzung der Fluoreszenzlebenszeit des FRET–Donors bemerkbar, was im vorliegenden Fall durch Fluoreszenzlebenszeitbildgebungsmikroskopie (FLIM) nachgewiesen wurde. Im Rahmen dieser Arbeit wurden die markierte CPK3 sowie ihre potentiellen Interaktionspartner heterolog in Tabakblattepidermiszellen exprimiert. Vier Interaktoren konnten vollumfänglich bestätigt werden, wohingegen die Interaktion der anderen Proteine, abhängig von der Nachweismethode und dem Expressionssystem, nicht konsistent sichtbar war. Die Erkenntnisse verdeutlichen, dass die Fluoreszenzlebenszeitspektroskopie eine wertvolle Vervollständigung im Methodenkomplex darstellt, um Protein–Protein Interaktionen nachzuweisen. Zusätzlich bietet diese Methode die Möglichkeit, Erkenntnisse im lebenden System zu gewinnen. Insgesamt stellen Lokalisationsstudien, BiFC und FRET–FLIM komplementäre Methoden dar, die für fundierte Ergebnisse im Zweifelsfall parallel verwendet werden müssen.

In Abschnitt 7 wurde ein neuartiges Mikroskop präsentiert, das die Aufnahme des Fluoreszenzanregungsspektrums mittels eines konfokal geführten Strahlengangs ermöglicht. Hierfür wurden verschiedene Komponenten kombiniert: Ein Mikroskop zur Einzelmolekülspektroskopie, ein Weißlichtlaser zur Anregung und ein Gittermonochromator zur Selektion der Anregungswellenlänge. Das Potential des gewählten Ansatzes wurde demonstriert durch die Aufnahme der Einzelmolekülspektren von Halbleiter–Nanopartikeln, sogenannten Quantenpunkten oder Qdots. Die Anregungsspektren wiesen die Eigenschaften auf, welche kennzeichnend für die Beobachtung einzelner Emitter sind, wie zum Beispiel Blinken oder Photobleichen in einem einzelnen Schritt. Des weiteren wurde die Beobachtung einzelner Emitter durch die zeitliche Analyse des Photonenstroms, der von der Probe emittiert wurde, in sogenannten Antibunching Experimenten sichergestellt. Die spektralen Eigenschaften der untersuchten Qdots wiesen große Gemeinsamkeiten auf, wenn die Anregung bei Energien deutlich jenseits der Halbleiter–Bandlücke erfolgte. Andererseits wiesen die Spektren starke individuelle Unterschiede im Bereich der Bandlücke auf, was auf die individuelle Größe der einzelnen Nanopartikel zurückzuführen ist. Es wurden einige Wellenlängen identifiziert, bei welchen die untersuchten Qdots eine erhöhte Wahrscheinlichkeit für einen Übergang in einen dunklen, nicht–emittierenden Zustand aufwiesen. Der Grund hierfür war allerdings nicht Gegenstand der hier gezeigten Experimente.

Das Mikroskop aus Abschnitt 7 wurde in einer weiteren Studie (Kapitel 8) verwendet. Hier wurden spektro–mikroskopische Untersuchungen an Chloroplasten lebender A. thaliana Pflanzen durchgeführt. Die untersuchten Pflanzen unterschieden sich in ihren Anzuchtbedingungen (d.h. in der Dauer der Photoperiode) und im Expressionslevel des NADP–abhängigen Malatenzyms (NADP–ME). Wenn die Pflanzen unter Kurztag–Bedingungen angezogen wurden, führte Überexpression des NADP–ME zu Kohlenstoffmangel und zu Zwergwuchs. Durch Emissions–Spektro–Mikroskopie konnte gezeigt werden, dass dieser Phänotyp des weiteren ein verändertes Mengenverhältnis zwischen Photosystem I und II aufweist. Eine weitergehende statistische Analyse der Daten weist darauf hin, dass dies auch dann geschieht, wenn kein weiterer physiologischer Phänotyp vorliegt. Die Energie–Transferkaskade in den Lichtsammelkomplexen (LHCs) der Photosynthese wurde mit den Mitteln der konfokalen Fluoreszenzanregungsspektroskopie untersucht. Hier konnte gezeigt werden, dass Pflanzen mit unterschiedlichem Expressionslevel von NADP–ME auch Änderungen in der spektralen Verteilung der Energiemenge aufweisen, welche in das Reaktionszentrum von PSII geleitet wird. Dies ist darauf zurückzuführen, dass die Pigmente innerhalb der LHCs unterschiedlich eingebettet werden, wodurch der Energietransfer in das Reaktionszentrum beeinflusst wird. Diese Erkenntnisse müssen zwingend in vivo gewonnen werden, da bei einer Präparation für in vitro–Untersuchungen der zelluläre Kontext notwendigerweise verloren geht.

Die Erkenntnisse in den Kapiteln 4 bis 8 wurden mit beugungslimitierter Konfokalmikroskopie erlangt. Neuartige Techniken, welche gelegentlich als “Nanoskopie” zusammengefasst werden, ermöglichen eine optische Auflösung jenseits des Beugungslimits durch das Schalten von Molekülen unter Sättigungsbedingungen. Die Nanoskopie wird derzeit intensiv in der Bildgebung angewandt, wobei die spektralen Informationen, welche ein Charakteristikum von Fluoreszenztechniken darstellen, üblicherweise vernachlässigt werden. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Möglichkeit, nanoskopische mit spektroskopischen Techniken zu kombinieren, diskutiert. Es wurde ein Weg aufgezeigt, wie die Fluoreszenzlebenszeitbildgebung mit Stimulierter Emissions Depletionsmikroskopie (STED) kombiniert werden kann. Hierfür wurde untersucht, wie sich die Fluoreszenzintensität nach gepulster Anregung und Depletion entwickelt. Es konnte gezeigt werden, dass die Fluoreszenzlebenszeitspektroskopie kompatibel ist mit der Depletion von Fluoreszenz mittels stimulierter Emission, wenn gepulste Laser verwendet werden, deren Pulslänge im typischen Anwendungsbereich der STED–Mikroskopie liegt. Des weiteren konnte gezeigt werden, dass die stimulierte Emission ein Prozess ist, deren Effizienz auch von der Größe der untersuchten molekularen Spezies abhängt, wobei große Moleküle verhältnismäßig eine höhere Effizienz aufweisen als kleinere. Dies liegt darin begründet, dass kleine Moleküle aufgrund ihres kleineren hydrodynamischen Radius eine geringere Rotationsdiffusionszeit aufweisen und sich somit in der Zeit zwischen Excitation und stimulierter Emission reorientieren können. Dies könnte sich als nützlich herausstellen für die Bildgebung lebender Zellen, da hier oft die recht großen AFPs zum Einsatz kommen. Die Bestimmung der relevanten Bildgebungsparameter erfordert eine detaillierte Kenntnis der relevanten photophysikalischen Parameter der eingesetzten Chromophore, womit sich der Kreis zu Kapitel 4 schließt.

 

Table of Contents

1          Introduction and outline of this work          1

1.1       Introduction   1

1.2       Outline            3

2          Theoretical background         5

2.1       Optical spectroscopy 5

2.2       Single–molecule spectroscopy and confocal microscopy    8

2.3       Structure of plant cells          12

2.4       Autofluorescent proteins      15

3          Materials and methods         19

3.1       Confocal microscopy  19

3.2       Molecular biology      21

3.3       Software and protein structures       24

4          Photophysical characterization of the redox–sensitive green fluorescent protein roGFP2 by ensemble and single–molecule spectroscopy    25

4.1       Introduction   26

4.2       Materials and methods         29

4.3       Ensemble parameters            31

4.4       Single–molecule spectroscopy          35

4.5       Discussion       37

4.6       Concluding remarks   39

5          Novel chimeric autofluorescent proteins as model system for multicolor Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC)            41

5.1       Introduction   42

5.2       Background information: Sequences of the parent proteins and influences by single mutations        45

5.3       Materials and methods         49

5.4       Spectral characterization of the generated BiFC chimeras 54

5.5       Chemical characterization:  acidity of the chromophore    58

5.6       Determination of ensemble photophysical parameters     62

5.7       Single–molecule emission spectroscopy and spectral distribution width 66

5.8       Discussion       70

5.9       Concluding remarks   74

 

6          In vivo  validation of putative protein-protein interaction by FRET–FLIM: a case study   75

6.1       Introduction   76

6.2       Background of this study       79

6.3       Materials and methods         81

6.4       Results            82

6.5       Discussion       84

6.6       Concluding remarks   87

7          Room temperature excitation spectroscopy of single quantum dots        89

7.1       Introduction   90

7.2       Materials and methods         91

7.3       Single–emitter  characteristics          95

7.4       Excitation spectra of single semiconductor nanocrystals   98

7.5       Discussion       101

7.6       Concluding  remarks  103

8          Photosynthesis in a different light: Spectro–microscopy for in vivo  characterization of chloroplasts      105

8.1       Introduction   106

8.2       Materials and methods         108

8.3       Results            111

8.4       Discussion       117

8.5       Concluding remarks   119

9          Towards spectro–nanoscopy: a perspective            121

9.1       Introduction   122

9.2       Materials and methods         124

9.3       Evaluation of the saturation intensity Isat  127

9.4       Implementation of fluorescence lifetime spectroscopy in nanoscopy       130

9.5       Discussion       132

9.6       Concluding  remarks  135

10        Summary        137

References      141

A          Scientific contributions          159

B          Academic  Teachers   163

C          German Summary      165

D          Curriculum vitae        169

E          Acknowledgement     171

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