Immunoassay-Entwicklung für die optische Bestimmung von humaner Pankreas-Lipase und dem Arzneistoff Amitriptylin

Dissertation der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät der Eberhard Karls Universität Tübingen.

Anne Katrin Krieg
ISBN: 978-3-944101-24-8
Veröffentlicht: 4. August 2014, 1. Auflage, Einband: Broschur, Abbildung und Tabellen: Zahlreiche zum Teil farbige Abbildungen, Seiten 168, Format Studienformat B5, Gewicht 0.49 kg
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Immunoassay-Entwicklung für die optische Bestimmung von humaner Pankreas-Lipase und dem Arzneistoff Amitriptylin

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Details

Anne Katrin Krieg

Immunoassay-Entwicklung für die optische Bestimmung von humaner Pankreas-Lipase und dem Arzneistoff Amitriptylin

Dissertation der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät der Eberhard Karls Universität Tübingen. Band 8 der Schriftenreihe LIFE SCIENCES.

 

168 Seiten. Zahlreiche  zum Teil farbige Abbildungen. Hardcover. Preis: 44,80 Euro. ISBN 978-3-944101-24-8. Rhombos-Verlag, Berlin 2014

 

Dekan: Professor Dr. Wolfgang Rosenstiel

http://www.ti.uni-tuebingen.de/Wolfgang-Rosenstiel.191.0.html

 

1. Berichterstatter:  Professor Dr. Günter Gauglitz

http://barolo.ipc.uni-tuebingen.de/

 

2. Berichterstatterin:         Professor Dr. Carolin Huhn

http://www.uni-tuebingen.de/de/42272

 

Professor Dr. Günter Gauglitz

Institut für Physikalische und Theoretische Chemie

Universität Tübingen

Abteilung Analytische Chemie

Auf der Morgenstelle 18

D-72076 Tübingen

Tel.: +49 (0)7071-29 76927

Fax:  +49 (0)7071-29 5772

http://barolo.ipc.uni-tuebingen.de/

 

Prof. Dr. Carolin Huhn

Institut für Physikalische und Theoretische Chemie

Universität Tübingen

AG Huhn - Effektbasierte Umweltanalytik

Auf der Morgenstelle 18

72076 Tübingen

Tel.: +49 7071 29 75655

Fax: +49 7071 29 5772

http://www.uni-tuebingen.de/de/42272

 

Zum Buch

In den vergangenen Jahren haben immunoanalytische Nachweise bei Biosensoren zunehmend an Bedeutung gewonnen. Auf Grund der hohen Spezifität von Antikörpern können niedrige Nachweisgrenzen erreicht und der Analyt auch in komplexen Matrices (etwa Nahrungsmittel und Blut) nachgewiesen werden. Diese Arbeit beschäftigt sich mit der Entwicklung neuer heterogener Immunoassays zur Bestimmung von humaner Pankreas-Lipase für die Bauchspeicheldrüsen-Diagnostik und des Psychopharmakons Amitriptylin (AMT) für Therapeutisches-Drug-Monitoring. Da sich die beiden nachzuweisenden Analyte grundlegend voneinander unterscheiden werden für beide Assays die Oberflächenchemie, die Regenerationslösung sowie die Assay-Prozedur individuell angepasst. Die Konzentrationsbestimmung erfolgt unter Verwendung der optischen Messmethoden RIfS (markierungsfrei) und TIRF (Fluoreszenzmarkierung). Untersucht wird auch die Inter- und Intra-Transducer-Reproduzierbarkeit sowie die Langzeitstabilität der Sensorbeschichtung. Für das kleine Molekül AMT wird außerdem die Kreuzreaktivität des Antikörpers gegenüber strukturverwandten Arzneistoffen getestet. Dadurch ist es möglich, die Summe mehrerer trizyklischer Antidepressiva zu bestimmen.

 

Stichworte: Biosensor, medizinische Diagnostik, Immunoassay, Therapeutisches Drug Monitoring

Allgemeiner Ausblick

Der Einsatz dieser Art Biosensoren ist auch für weitere organspezifische Parameter möglich und sinnvoll. Dadurch würde sich ein Notfalldiagnose-Gerät für akute Organschäden entwickeln lassen. Ein solches POCT-Gerät wäre vor allem für Praxen von Allgemeinmedizinern aber auch für kleine Kliniken im ländlichen Raum nützlich, die sich die teuren Hochdurchsatzgeräte eines Klinik-Zentrallabors nicht leisten können. Dadurch können deren Patienten schneller und zielgerichteter therapiert bzw. an einen Spezialisten verwiesen werden. Dadurch könnte die Gefahr einer Verschleppung der Erkrankung verringert werden. Da sich alle Komponenten des verwendeten TIRF-Aufbaus einfach miniaturisieren lassen, wäre es durchaus möglich ein preiswertes und kompaktes Gerät zu entwickeln. Zur Bedienung dieses Gerätes wäre auch kein geschultes Personal nötig.

Außerdem konnte gezeigt werden, dass optische Biosensoren, basierend auf der Messmethode RIfS, für die schnelle Konzentrationsbestimmung von Arzneistoffen und Arzneistoffklassen eingesetzt werden kann. Durch die aufgezeigte konsequente Weiterentwicklung könnte effektives Therapeutisches Drug Monitoring zügiger in die verschiedensten Bereiche der Medizin Einzug halten. Davon profitieren letztendlich vor allem die Patienten, da weniger starke Nebenwirkungen auftreten und der Therapieerfolg schneller eintritt.

 

Förderhinweis:

Das IGF-Vorhaben 16696N der Forschungsvereinigung F.O.M. (Forschungsvereinigung Feinmechanik, Optik und Medizintechnik e.V., Werderscher Markt 15, 10117 Berlin) wurde über die AiF im Rahmen des Programms zur Förderung der Industriellen Gemeinschaftsforschung (IGF) vom Bundesministerium für Wirtschaft und Technologie aufgrund eines Beschlusses des Deutschen Bundestages gefördert.

Inhalt 

1            Motivation und Zielsetzung......................................................... 1 

 

2            Theorie......................................................................................... 5 

2.1       Physikalische und physikochemische Grundlagen.................... 5

2.1.1       Brechungsindex........................................................................................... 5

2.1.2       Lichtbrechung und -reflexion.................................................................... 6

2.1.3       Reflektivität und Transmission.................................................................. 7

2.1.4       Totalreflexion und evaneszentes Feld.................................................... 7

2.1.5       Interferenz an dünnen Schichten............................................................. 9

2.1.6       Lumineszenz.............................................................................................. 10

2.2       Messmethoden........................................................................ 13

2.2.1       Reflektometrische Interferenzspektroskopie....................................... 13

2.2.2       Totale Interne Reflexion-Fluoreszenz................................................... 14

2.2.3       Oberflächencharakterisierung................................................................ 15

2.3       Biochemische und bioanalytische Grundlagen........................ 20

2.3.1       Proteine....................................................................................................... 20

2.3.2       Antikörper.................................................................................................... 22

2.3.3       Antigene...................................................................................................... 25

2.3.4       Antikörper-Antigen-Wechselwirkungen................................................ 26

2.3.5       Untersuchte Analyte.................................................................................. 26

2.3.6       Immunoassay Testformate..................................................................... 28

2.4       Therapeutisches Drug Monitoring (TDM).................................. 34

2.4.1       Allgemeines............................................................................................... 34

2.4.2       Trizyklische Antidepressiva..................................................................... 36

 

3            Material und Methoden............................................................ 37 

3.1       Verbrauchsmaterialien............................................................. 37

3.1.1       Chemikalien............................................................................................... 37

3.1.2       Proteine....................................................................................................... 38

3.1.3       Pufferaustausch bei Proteinlösungen................................................... 40

3.1.4       Fluoreszenzmarkierung von Proteinen................................................. 41

3.1.5       Lösungen.................................................................................................... 42

3.1.6       Transducer.................................................................................................. 43

3.2       Geräte...................................................................................... 45

3.2.1       RIfS............................................................................................................... 45

3.2.2       TIRF.............................................................................................................. 46

3.2.3       Weitere Geräte........................................................................................... 48

3.3       Datenauswertung..................................................................... 50

3.3.1       Auswertung RIfS........................................................................................ 50

3.3.2       Auswertung TIRF....................................................................................... 54

 

4            Oberflächenmodifizierung........................................................ 57 

4.1       Vorbereitende Funktionalisierungsschritte............................... 57

4.1.1       Reinigung und Aktivierung der Glasoberfläche.................................. 57

4.1.2       Silanisierung.............................................................................................. 58

4.1.3       Beschichtung mit einem Biopolymer.................................................... 59

4.1.4       Umfunktionalisierung mit Glutarsäureanhydrid.................................. 62

4.2       Carbodiimid-vermittelte Immobilisierung................................. 63

4.2.1       Kovalente Immobilisierung kleiner organischer Moleküle................ 63

4.2.2       Kovalente Immobilisierung von Proteinen........................................... 64

4.3       Protein-Immobilisierung mittels DMP-Linker........................... 68

4.4       Immobilisierung mit kupferfreier Click-Chemie........................ 69

4.4.1       Funktionalisierung der Pankreas-Lipase.............................................. 69

4.4.2       Cyclooctin-funktionalisierte Oberfläche................................................ 70

4.4.3       Azid-funktionalisierte Oberfläche........................................................... 71

4.5       Charakterisierung der modifizierten Oberflächen..................... 72

4.5.1       Oberflächentopographie.......................................................................... 72

4.5.2       Schwingungsspektren der organischen Schichten............................ 75

4.5.3       Benetzungsfähigkeit................................................................................. 77

 

5            Assay-Entwicklung..................................................................... 81 

5.1       Quantitativer Immunoassay für die Pankreas-Lipase................ 82

5.1.1       Experimente zum Sandwich-Assay....................................................... 82

5.1.2       Online-Sandwich-Assay........................................................................... 87

5.1.3       Bindungshemmtest................................................................................... 97

5.1.4       Vergleich verschiedener poly- und monoklonaler Antikörper........ 100

5.1.5       Alternative Anbindung der Lipase mittels Click-Chemie................ 104

5.1.6       Konzentrationsabhängigkeit des Bindungssignals.......................... 106

5.1.7       Kalibrierung des Bindungshemmtest in Puffer................................. 108

5.1.8       Markieren von a-HPL Antikörpern mit Dy-652.................................. 111

5.1.9       Messungen auf einem miniaturisierten TIRF-Aufbau...................... 113

5.2       Quantitativer Immunoassay für Amitriptylin........................... 117

5.2.1       Bindungshemmtest................................................................................ 117

5.2.2       Optimierung des Bindungssignals...................................................... 119

5.2.3       Kalibrierung in Puffer............................................................................. 122

5.2.4       Kreuzreaktivitäten mit anderen TCAs................................................. 125

5.2.5       Inter-Transducer-Reproduzierbarkeit.................................................. 127

5.2.6       Langzeitstabilität der Sensorbeschichtung........................................ 129

 

6            Zusammenfassung und Ausblick.............................................. 133 

6.1       Ein Immunoassay für die humane Pankreas-Lipase............... 133

6.2       Ein Immunoassay für Amitriptylin.......................................... 135

6.3       Allgemeiner Ausblick............................................................. 137

 

7            Literatur................................................................................... 138 

 

8            Anhang..................................................................................... 149 

8.1       Abkürzungsverzeichnis.......................................................... 149

8.2       Fit-Parameter......................................................................... 151

8.2.1       HPL-Assay: Fit-Parameter für die Kalibrierfunktionen.................... 151

8.2.2       AMT-Assay: Fit-Parameter für die Kalibrierfunktionen.................... 152

8.3       Geräteeinstellungen............................................................... 153

8.3.1       Rasterkraftmikroskop (AFM)................................................................. 153

8.3.2       Ramanspektrometer............................................................................... 153

8.4       Förderhinweis........................................................................ 155

8.5       Akademische Lehrer.............................................................. 156

8.6       Lebenslauf............................................................................. 157

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