Identification and characterization of Arabidopsis mutants associated with xyloglucan metabolism

Zugl. Dissertation Humboldt-Universität zu Berlin

Lutz Neumetzler

Kurzübersicht

Zugl. Dissertation Humboldt-Universität zu Berlin
ISBN: 978-3-941216-39-6
Veröffentlicht: Februar 2010, 1. Auflage, Einband: Broschur, Seiten 210, Format DIN B5 (176x250 mm), Gewicht 0.4 kg
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Identification and characterization of Arabidopsis mutants associated with xyloglucan metabolism

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Details

Gutachter/innen:
1. Prof. Dr. Rudolf Ehwald (Humboldt-Universität, Berlin)
2. Dr. habil. Ingo Burgert (Humboldt-Universität, Berlin)
3. Dr. habil. Alisdair Fernie (Universität Potsdam)

Cell Biology, Humboldt-Universität zu Berlin, Prof. Dr. Rudolf Ehwald
http://www2.hu-berlin.de/biologie/cellbio/
Max-Planck-Institut für Kolloid- und Grenzflächenforschung, Potsdam
Dr. habil. Ingo Burgert
Max-Planck-Institut für molekulare Pflanzenphysiologie, Potsdam    
Dr. Alisdair Fernie
http://www-de.mpimp-golm.mpg.de/instUeberInstitut/index.html
 

 

Summary

Due to the increasing demand of sustainable commodities cell wall metabolism has come more and more to the public fore in recent years. The aim of the project was to uncover and study unknown components of the xyloglucan metabolism of Arabidopsis thaliana. In a forward genetic screen 38 Arabidopsis EMS mutants with altered xyloglucan (axy) structures were isolated and grouped into eight classes according to their xyloglucan mass profiles (axy1 to axy8). Among those classes were mutants displaying different modifications in xyloglucan side chain composition, e.g. altered levels of galactosylation, fucosylation or O-acetylation. The genetic basis of one class (axy8) was identified using four allelic lines and a map-based cloning approach revealed a new, single copy gene encoding an unknown, apoplastic α-fucosidase specifically acting on xyloglucans. Point mutations in AXY8 caused complex xyloglucan alterations, such as a relative increase of the fucose and galactose content as well as a reduced xylosylation. Cell wall changes were accompanied with the appearance of novel, hitherto unknown oligosaccharides showing modified fine structures with terminal fucosyl moieties. Global transcript analysis of etiolated axy8 seedlings demonstrated that expression of known or putative biosynthetic cell wall genes were largely unaffected but genes involved in cell wall remodeling or sugar degradation were up-regulated in the mutant lines. In summary, this study infers that the level of xyloglucan fucosylation in etiolated Arabidopsis seedlings is not biosynthetically controlled by Golgi located glycosyl transferases but that it is instead determined by the action of the cell wall located and side chain degrading α-fucosidase AXY8.

Zusammenfassung

In den letzten Jahren ist der Zellwandmetabolismus vor allem aufgrund des steigenden Bedarfs an nachwachsenden Rohstoffen immer mehr ins allgemeine Interesse gerückt. Ziel dieser Arbeit war es unbekannte Komponenten des Xyloglukanstoffwechsels aufzudecken und in Arabidopsis thaliana zu studieren. Hierzu wurde eine vorwärts gerichtete Gensuche (forward genetic screen) benutzt, um 38 EMS Mutanten zu identifizieren, die anhand ihrer Xyloglukan Massenprofile in acht Klassen eingeteilt wurden (axy1 bis axy8). Die Klassen waren durch Unterschiede in der Xyloglukan Seitenkettenkomposition, wie zum Beispiel einer veränderten Galaktosylierung, Fukosylierung oder O-Azetylierung,   gekennzeichnet. Im Folgenden wurde die Klasse axy8 anhand von vier Allelen genetisch untersucht und das zugrundeliegende Gen mit Hilfe eines sequenzgestützten Klonierungsverfahrens (map-based cloning) identifiziert. AXY8 kodiert eine unbekannte, zellwandlokalisierte und xyloglukanspezifische α-Fukosidase. Punktmutationen in diesem Gen resultierten in komplexen Veränderungen der Xyloglukan Zusammensetzung, die sich in einer erhöhten relativen Fukosylierung und Galaktosylierung, sowie in einer Reduzierung des Xyloseanteils widerspiegeln. Des Weiteren traten in axy8 Zellwänden neuartige und bis dahin unbekannte Oligosaccharide auf, deren Anreicherung und Analyse eine ungewöhnliche Blockstruktur mit terminalen Fukoseeinheiten ergab. Transkriptomuntersuchungen an etiolierten Keimlingen zeigten nahezu keine Veränderungen der Expression von Zellwand synthetisierenden Glykosyltransferasen. Im Gegensatz dazu waren Gene in der Mutante überexpremiert, die Enzyme von Zellwand degradierenden und modulierenden Eigenschaften kodieren. Zusammenfassend führten die Ergebnisse zu dem Schluss, dass die Xyloglukan Fukosylierung nicht auf der Ebene der Golgi lokalisierten Biosynthese kontrolliert wird, sondern durch die extrazelluläre α-Fukosidase AXY8.

Table of content

1    Introduction    1
1.1    The plant cell wall    1
1.2    Xyloglucan structure and properties    4
1.2.1    Fine structure of xyloglucan    4
1.2.2    Properties of xyloglucan    7
1.3    Biosynthesis and Metabolism    8
1.3.1    Biosynthesis    8
1.3.2    Xyloglucan endo-transglycosylases/hydrolases (XTHs)    14
1.3.3    Xyloglucan mobilisation/degradation    16
1.4    Roles of xyloglucan in plant growth and development    18
1.5    Isolation and structural analysis of xyloglucan    20
1.6    Biotechnological applications of cell walls    22
1.7    Aim of the project    24

2    Material and Methods    25
2.1    Materials    25
2.1.1    Chemicals    25
2.1.2    General laboratory equipment    25
2.1.3    Primers used for mapping of the axy8 mutation    25
2.1.4    Antibodies for immunolocalisation of wall polysaccharides    26
2.1.5    Plant lines    28
2.1.6    Growth conditions    28
2.2    Methods    29
2.2.1    Extraction of plant cell wall material    29
2.2.2    Xyloglucan oligosaccharide mass profiling (OLIMP)    29
2.2.3    Preparative extraction and analysis of unknown xyloglucan oligosaccharides (XyGOs)    31
2.2.4    Structural analysis of unknown XyGOs using MALDI- MS/MSn    32
2.2.5    Comprehensive Microarray Polymer Profiling (CoMPP)    32
2.2.6    Monosaccharide composition; determination of alditol acetates
by GC-MS    34
2.2.7    Uronic acid content    35
2.2.8    Crystalline cellulose content    35
2.2.9    Hexose content    36
2.2.10    High performance anion exchange chromatography (HPAEC)
of carbohydrate derived monomers    36
2.2.11    Histology and Microscopy (Immuno-labeling)    36
2.2.12    Genetic analysis and positional cloning    37
2.2.13    RNA isolation of plant material    37
2.2.14    Expression profiling    38

3    Results    39
3.1    Identification of mutants with altered xyloglucan profile (axy) in
Arabidopsis thaliana using oligosaccharide mass profiling (OLIMP)    39
3.1.1    Screening for mutants with altered xyloglucan mass profile
(axy mutants)    41
3.2    O-acetylation of xyloglucans (axy4, axy5)    45
3.2.1    axy4 - OLIMP    45
3.2.2    axy5 - OLIMP    46
3.3    axy8 – etiolated seedlings    47
3.3.1    OLIMP    47
3.3.2    Fragmentation of unknown oligosaccharides using MS/MSn    50
3.3.3    Purification and sugar analysis of unknown oligosaccharides    52
3.3.4    Cell wall analysis of etiolated seedlings    57
3.4    axy8 - Cell wall analysis of other organs    63
3.4.1    Rosette leaves    63
3.4.2    Roots    64
3.4.3    Seeds    65
3.4.4    Flower buds    66
3.5    axy8 - Histology and Microscopy    67
3.6    axy8 – Morphology    68
3.6.1    Seedlings    68
3.6.2    Roots    69
3.6.3    Aerial parts    70
3.7    axy8 - Genetic analysis and positional cloning    73
3.8    In silico analysis of AXY8: a putative alpha-L-fucosidase    74
3.9    axy8 - Expression profile analyses of etiolated seedlings    79

4    Discussion    89
4.1    Identification of xyloglucan mutants    89
4.2    Mutations in AXY8 are responsible for xyloglucan phenotype    90
4.3    The role and regulation of xyloglucan fucosylation    91
4.3.1    Level of XyG fucosylation in etiolated seedlings is regulated
by apoplastic AXY8    91
4.4    Impaired apoplastic fucosyl metabolism causes complex xyloglucan alterations resulting in reduced cell wall stiffness    94
4.4.1    Structure of novel oligosaccharides    95
4.4.2    Appearance of novel oligosaccharides correlates with
XTH9 and BGLU19 expression    96
4.4.3    Impaired remodeling of the outer epidermal wall results
in reduced stiffness    100
4.5    Open Questions    102

5    Summary    105

6    Zusammenfassung    107

7    Appendix    109

8    References    163

9    Acknowledgement    193

10    List of publications and presentations    195

10.1    List of publications:    195
10.2    Presentations:    195

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