Biomolekulare Interaktionsanalyse des humanen Estrogen Rezeptors alpha

Band 6 der Schriftenreihe LIFE SCIENCES

Peter Fechner
ISBN: 978-3-941216-89-1
Veröffentlicht: Mai 2011, 1. Auflage, Einband: Hardcover, Abbildung und Tabellen: Zahlr. Abb. u. Tab., z.T. in Farbe, Seiten 160, Format 17,6 x 25,0 cm, Gewicht 0.34 kg
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Biomolekulare Interaktionsanalyse des humanen Estrogen Rezeptors alpha

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Dissertation an der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät der Eberhard Karls Universität Tübingen

Dekan:                                    Prof. Dr. Wolfgang Rosenstiel
1. Berichterstatter:                Prof. Dr. Günter Gauglitz
2. Berichterstatter:                Prof. Dr. Udo Weimar

Die Arbeit beschäftigt sich mit der Entwicklung und Verwendung verschiedener bioanalytischer Methoden – zum Großteil optischer Methoden – in Kombination mit einem nukleären Rezeptor – dem Estrogen Rezeptor alpha (ERa) – zur Generierung von Biosensoren.
Verschiedene Assays unter Verwendung dieser Biosensoren erlauben es, sogenannte Endokrine Disruptoren (also potenziell gefährliche Stoffklassen) in verschiedensten Probenmatrices zu detektieren. Es werden Möglichkeiten zur Identifizierung von pharmakologisch-interessanten Verbindungen aufgezeigt.
Des Weiteren können die Daten der Biosensor-basierten Analytik in Form von kinetischen und thermodynamischen Konstanten dazu verwendet werden, die Güte von artifiziellen, Computer-basierten Simulationen zu beurteilen und bei Bedarf zu verbessern, um neue Wege der wirkungsbasierten Analytik zu beschreiten. Der Estrogen Rezeptor alpha dient hierbei als Modellsystem und die hier gewonnen Erkenntnisse können dazu benutzt werden, um neues Wissen über die anderen 47 Vertreter der nukleären Rezeptoren zu erlangen.


Einleitung

Der Mensch sieht sich Zeit seines Lebens einer Vielzahl von Umwelteinflüssen ausgesetzt. Diese können vorteilhaft oder auch schädlich sein. Besonders gravierend können diese Einflüsse sein, wenn sie mit dem menschlichen Hormonsystem interferieren. Neben physikalischen Effekten (wie Temperatur, Druck, Strahlung) sind vor allem Chemikalien in der Lage, das Hormonsystem entscheidend zu beeinflussen bzw. zu steuern. Sind diese Chemikalien im Fall der Hormone (z.B. Estrogen, Insulin, Adrenalin, …) für den Organismus (über)lebenswichtig, so sind einige andere Chemikalien hingegen nicht physiologischen Ursprungs und dennoch in der Lage mit den natürlichen Hormonen zu konkurrieren und unvorhersehbare Effekte hervorzurufen. Diese chemisch uneinheitliche Klasse an Chemikalien wird in der Literatur unter dem Begriff hormonaktive Substanzen oder Endokrine Disruptoren (engl. Endocrine Disrupting Chemicals – EDCs) zusammengefasst.
Sowohl die Aufklärung der Mechanismen als auch die Detektion und das Monitoring dieser EDCs stellt die Wissenschaft und Analytik seit Jahrzehnten immer wieder aufs Neue vor Herausforderungen. Es gibt eine Vielzahl verschiedenster Ansätze diese Herausforderungen zu bewältigen. Die Ansätze hierfür reichen von der klassischen Analytik z.B. HPLC-gekoppelter Massenspektrometrie bis hin zu Analysemethoden, die erst in den letzten Jahren mit dem Voranschreiten der Gentechnik ermöglicht worden sind, wie z.B. spezielle Organismen (von einzelnen Zelllinien oder Hefen, bis hin zu Mausmodellen). Des Weiteren wird es dank andauernder Fortschritte in der Informatik möglich, potentielle EDCs mittels virtuellem screening durch den Einsatz von Computermodellen ohne jeglichen realen Laboraufwand zu identifizieren und vorherzusagen.
Es ergeben sich zwei Fragestellungen: Wie lassen sich EDCs möglichst elegant nachweisen oder gar vorhersagen und können diese Methoden dann auch dazu verwendet werden tiefere Einblicke und Erkenntnisse in die Wirkweise der EDCs zu erlangen?
Da die meisten EDCs direkt mit dem Hormonsystem interferieren können, wäre es elegant, genau diese Bindungsstrukturen, welche im Hormonsystem vorkommen, zu verwenden, um EDCs verlässlich nachzuweisen. Die Bindungsstrukturen der EDCs sind in der überwältigenden Mehrheit der Fälle spezielle Rezeptoren: die sogenannten Nukleären Rezeptoren (NR). Diese spielen eine entscheidende Rolle in der Signalübertragung des Hormonsystems. Wäre es nun möglich, diese Nukleären Rezeptoren als natürliche Bindungsstrukturen zu abstrahieren und als Erkennungsstrukturen für bioanalytische Verfahren einzusetzen, könnte man, sowohl EDCs detektieren als auch Einblicke in die Wechselwirkungen und Bindungsvorgänge zwischen EDC oder natürlichen Liganden der NR erhalten.
Im Rahmen des network of excellence CASCADE (FOOD-CT-2004-506319) wurde genau dieser Ansatz verfolgt und um die Option erweitert, diese ohnehin schon neuen Ansätze mit in silico Methoden, also Computer-gestützten Methoden, zu kombinieren. Ein wichtiger Ansatzpunkt ist hier die sogenannte wirkungsbezogene Analytik (effect directed analytics – EDA). Diese wird erst durch die Verwendung von natürlichen Rezeptoren ermöglicht. Sie erlaubt die Abschätzung der biologischen Potenz eines Stoffes aufgrund der Affinität des Stoffes zu dem Rezeptor. Vor allem aber ist es möglich, die Summensignale verschiedener Stoffe zu quantifizieren, um mögliche Risiken abzuschätzen.
Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der Entwicklung und Verwendung verschiedener bioanalytischer Methoden – zum Großteil optischer Methoden – in Kombination mit einem Nukleären Rezeptor – dem Estrogen Rezeptor alpha (ER?) – zur Generierung von Biosensoren. Verschiedene assays unter Verwendung dieser Biosensoren erlauben es, EDCs in verschiedensten Probenmatrices zu detektieren, Möglichkeiten der Identifizierung von pharmakologisch-interessanten Verbindungen werden aufgezeigt und ultimativ können die Daten der Biosensor-basierten Analytik in Form von kinetischen und thermodynamischen Konstanten dazu verwendet werden, die Güte von Systemen zu beurteilen und bei Bedarf zu verbessern, um neue Wege der wirkungsbasierten Analytik zu beschreiten.

 

Inhaltsverzeichnis

1    Einleitung und Motivation    1
2    Theorie    5
2.1    Optische Grundlagen    6
2.2    Reflektometrische Interferenzspektroskopie (RIfS)    9
2.3    Proteine    11
2.4    Nukleäre Rezeptoren (NR)    13
2.5    Estrogen Rezeptor ? (ER?)    16
2.6    Endokrine Disruptoren (EDCs)    18
2.7    Nukleinsäuren    22
2.8    Docking    24
2.9    Kinetik    26
2.9.1    Kinetik in homogener Phase    28
2.9.2    Kinetik an heterogener Phase    29
2.9.3    Bestimmung der kinetischen Konstanten    29
3    Material und Methoden    33
3.1    Geräte    34
3.2    Software und Internetadressen    35
3.3    Lösungen    36
3.4    Oligos    36
3.5    Grundchemikalien und Proteine    37
3.6    Organische Liganden für Bindungsexperimente    39
3.7    Oberflächenmodifizierungen    43
3.7.1    Immobilisierung von DNA/LNA    43
3.7.2    Immobilisierung von organischen Liganden    44
3.7.3    Immobilisierung von biotinylierten Peptiden    45
3.8    Fluidik    45
3.9    Reflektometrische Interferenzspektroskopie (RIfS)    47
3.10    Kinetische Auswertungen    49
3.11    Docking    50
3.12    Stereoskopie    52
4    Ergebnisse und Diskussion    55
4.1    Design einer geeigneten Transduceroberfläche    56
4.1.1    DNA-modifizierte Oberflächen    56
4.1.2    Ligand-modifizierte Oberflächen    59
4.1.3    Peptid-modifizierte Oberflächen    69
4.2    Kinetische Betrachtungen von Rezeptor / Ligand Interaktionen    74
4.2.1    Reaktionen an heterogener Phase    75
4.2.2    Reaktionen in homogener Phase    90
4.3    In silico screening    98
4.3.1    Auswahl der Modelle    99
4.3.2    Visualisierung des dockings    101
4.3.3    Beurteilung des dockings    107
4.3.4    Korrelation zwischen in silico und in vitro Ergebnissen    110
4.4    Analyse von estrogenartigen Substanzen in Brotproben    111
4.5    Metabolisierung von AhR-Liganden zu ER?-Liganden    113
4.6    Aufklärung des Mechanismus der Interaktion zwischen
Cadmium und ER?    115
5    Zusammenfassung    121
6    Ausblick    125
7    Anhang    129
7.1    fit-Parameter „4.2.2 Reaktionen in homogener Phase“    130
7.2    Literatur    133
7.3    Abbildungsverzeichnis    141
7.4    Publikationen    147
7.4.1    Publikationen    147
7.4.2    Sonstige Publikationen    147
7.4.3    Vorträge    148
7.4.4    Poster    148
7.5    Akademische Lehrer    149
7.6    Lebenslauf    150

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